Om DNA in levende cellen heel precies te herschrijven, gebruiken onderzoekers van over de hele wereld steeds vaker een bacterieel verdedigingsmechanisme genaamd CRISPR-Cas9. Deze nieuwe techniek heeft gene editing een stuk eenvoudiger en preciezer gemaakt. Maar hoe deze systemen in de natuur functioneren, is nog niet helemaal duidelijk. Onderzoekers van de TU Delft hebben nu de rol vastgesteld van een van een eiwit dat bij veel CRISPR-systemen betrokken is: Cas4. Het blijkt dat dit eiwit 'herinneringen' helpt vormen van binnenvallende virussen. De virusherinneringen die met Cas4 worden verkregen helpen de cel om een virus bij de volgende aanval snel te ontdekken en uit te schakelen, en vergroot zo de overlevingskans van de bacterie. De ontdekking is een belangrijke nieuwe stap in de richting van een volledig begrip van CRISPR-systemen.

Voor het menselijk oog is het onmogelijk om te zien, maar virussen en bacteriën zijn in een oorlog met elkaar verwikkeld. Dagelijks doden kleine virusachtige deeltjes, bacteriofagen genaamd, ongeveer een derde van alle bacteriën in de wereldzeeën. "Dergelijke virussen injecteren hun DNA of RNA in een bacterie om te proberen de controle over de cel te krijgen", legt Dr. Stan Brouns van de TU Delft uit. "En als de kaping succesvol is, kan het virus de bacterie gebruiken als een klein fabriekje dat kopieën van zichzelf produceert." 

Genetisch geheugen
Om ze te beschermen tegen virussen, heeft de evolutie bacteriën op hun beurt uitgerust met verdedigingsmechanismen zoals CRISPR-Cas9. Deze systemen kunnen viraal DNA vinden en kapot knippen, waardoor de bedreiging geneutraliseerd wordt. Maar voordat dit kan gebeuren, moet een bacterie een soort ‘genetische herinnering’ aan een virus hebben. Het moet het virus als een bedreiging herkennen.

Zulke ‘herinneringen’ worden gevormd als een bacterie stukje van het virus-DNA neemt en dit in zijn eigen genetische code inbouwt. Als hetzelfde type virus de bacterie opnieuw aanvalt, herkent de cel de indringer en kan hij een ‘knipeiwit’ zoals Cas9 in stelling brengen. Met een stuk viraal RNA als een soort 'spiekbriefje' gaat het eiwit op jacht naar het virus. Het Cas-eiwit knipt het vijandige genetische materiaal dat het vindt kapot, en de bacterie overleeft de aanval.

DNA-fragmenten
Wetenschappers wisten al dat er meerdere eiwitten betrokken zijn bij elk CRISPR-systeem. Maar tot nu toe was de rol van Cas4 onduidelijk. "We wisten wel dat het belangrijk moest zijn, omdat dit eiwit in de meeste CRISPR-systemen aanwezig is", zegt promovendus Sebastian Kieper, die samen met Cristóbal Almendros het project leidde.

Om erachter te komen wat Cas4 doet, introduceerden de onderzoekers het cas-gen in E. coli-cellen die al een aantal hoofdcomponenten van het CRISPR-verdedigingssysteem bevatten. In andere cellen introduceerden ze dat gen juist niet. Brouns: "We ontdekten dat een bacterie in de afwezigheid van Cas4 nog steeds herinneringen vormde aan een indringer, maar dat die herinneringen geen bescherming boden." Met andere woorden, pas wanneer Cas4 aanwezig was werden stukjes viraal DNA in het genoom van de bacterie ingebracht die de cel daadwerkelijk virusresistentie gaven.

Functionele herinneringen
Verdere onderzoeken toonden aan waarom bacteriën de herinneringen die ze zonder Cas4 vormen niet kunnen gebruiken. Dit bleek te maken te hebben met PAMs (Protospacer Adjacent Motifs), korte DNA-sequenties bestaande uit een klein aantal basenparen die fungeren als herkenningspunt voor eiwitten als Cas9. "Iedereen die aan gene editing doet met Cas9 weet dat het selecteren van een PAM cruciaal is voor het succes van het experiment”, aldus Brouns.

Bacteriën hebben deze PAMs ook nodig. "Bij het selecteren van een stukje DNA dat als herinnering in het bacteriële genoom wordt ingebracht, moet een CRISPR-systeem een sequentie kiezen die ook door een PAM wordt geflankeerd", legt Brouns uit. "Een Cas-eiwit gebruikt de PAM-sequentie vervolgens om zijn doel te vinden. Het laat DNA-sequenties die niet door een PAM worden geflankeerd met rust. PAMs beschermen bacteriën zo ook, omdat ze Cas-eiwitten ervan weerhouden het DNA van de cel zelf kapot te knippen.

De rol van Cas4 is om ervoor te zorgen dat alleen sequenties die worden geflankeerd door de juiste PAM worden ingebracht in het DNA van een bacterie. Dit leidt tot de eerder genoemde ‘functionele herinneringen’, die daadwerkelijk bruikbaar zijn wanneer een virus een bacterie opnieuw probeert aan te vallen.

De wetenschappers onderzoeken nu hoe Cas4 precies te werk gaat, en hoe deze bevinding kan worden gebruikt. Mogelijk kan adaptieve immuniteit in organismen worden geïntroduceerd die niet van nature over een CRISPR-afweersysteem beschikken.


******

Paper:
‘Cas4 Facilitates PAM-Compatible Spacer Selection during CRISPR Adaptation’
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.02.103

Beeldcredits: Getty Images/TU Delft

Meer informatie:Sleutelen aan het leven’, onderzoeksverhaal van de TU Delft over CRISPR-Cas9.

Contact:

Jerwin de Graaf (persvoorlichter TU Delft)
J.N.deGraaf@tudelft.nl
+31 (0)6 – 42 71 72 27

Dr. Stan Brouns (onderzoeker TU Delft)
S.J.J.Brouns@tudelft.nl
+31 (0)152783920