Probleem in de microscopie na decennia opgelost

Weefsels, cellen en eiwitten onder de microscoop bekijken helpt ons om ziektes te voorkomen en bestrijden. Daarvoor moeten we heel precies de afmetingen van de biologische structuur kunnen bepalen. Maar zo’n biologisch preparaat kan onder de lichtmicroscoop platter lijken dan het werkelijk is. Onderzoekers van de TU Delft hebben nu voor het eerst aangetoond dat deze vervorming niet constant is, in tegenstelling tot waar veel wetenschappers decennialang vanuit gegaan zijn. De doorbraak, gepubliceerd in Optica, bevestigt een verwachting van Nobelprijswinnaar Stefan Hell uit de jaren 90. Met een online rekentool en software kan elke onderzoeker nu de juiste diepte van een biologisch preparaat achterhalen.

Platgedrukt preparaat

Bij het bekijken van biologische preparaten met een microscoop raakt de lichtbundel verstoord als de lens van het objectief zich in een ander medium bevindt dan het preparaat. Door bijvoorbeeld met een lens omgeven door lucht naar een waterig preparaat te kijken buigen de lichtstralen sterker af in de lucht rond de lens dan in het water. Deze verstoring leidt ertoe dat de gemeten diepte in het preparaat kleiner is dan de werkelijke diepte. Het preparaat lijkt dan platgedrukt.

“Dit probleem is al lang bekend en vanaf de jaren 80 zijn er al theorieën ontwikkeld om een correctiefactor voor die dieptebepaling te bepalen. Al deze theorieën gingen er echter vanuit dat deze factor constant was, dus onafhankelijk van de diepte in het preparaat. Dit ondanks dat de latere Nobelprijswinnaar Stefan Hell al in de jaren 90 opgemerkt heeft dat deze schaling wel eens diepte-afhankelijk zou kunnen zijn”, legt universitair hoofddocent Jacob Hoogenboom uit.

Berekeningen, experimenten en webtool

Sergey Loginov, voormalig postdoc bij de TU Delft, heeft met berekeningen en een wiskundig model laten zien dat het preparaat dichter bij de lens inderdaad sterker platgedrukt lijkt dan verder van de lens vandaan. Promovendus Daan Boltje en postdoc Ernest van der Wee hebben vervolgens in het lab bevestigd dat de correctiefactor diepte-afhankelijk is. Van der Wee: “We hebben onze resultaten gebundeld in een webtool en in software die bij het artikel is meegeleverd. Met deze tools kan iedereen de precieze correctiefactor voor hun experiment bepalen.”

Afwijkingen en ziektebeelden begrijpen

“Mede dankzij onze rekentool kunnen wij nu heel precies een eiwit en zijn omgeving uit een biologisch systeem snijden om de structuur te bepalen met elektronenmicroscopie. Deze vorm van microscopie is heel complex, tijdrovend en ontzettend duur. Zeker weten dat je naar de juiste structuur kijkt is dus erg belangrijk”, aldus Boltje. “Met onze preciezere dieptebepaling hoeven we veel minder tijd en geld te besteden aan preparaten die het biologische target gemist hebben. Uiteindelijk kunnen we zo meer relevante eiwitten en biologische structuren bestuderen. En het bepalen van de precieze structuur van een eiwit in een biologisch systeem is cruciaal om afwijkingen en ziektebeelden te kunnen begrijpen en uiteindelijk te bestrijden.”

Over de webtool
In de webtool kun je de relevante details van je experiment invullen, zoals de brekingsindices, de openingshoek van het objectief en de golflengte van het gebruikte licht. De tool geeft dan de curve weer voor de diepte-afhankelijke schalingsfactor. Die data kun je ook exporteren voor eigen gebruik. Daarnaast kun je het resultaat plotten in combinatie met het resultaat van ieder van de bestaande theorieën.